Clasificarea genetică si moleculara a grupurilor de tulpini PVY

 

Clasificarea genetică a grupurilor de tulpini PVY

                        

       PVY se prezintă sub forma unui complex de tulpini sau grupuri de tulpini, care pot fi diferenţiate pe baza reacţiilor faţă de o serie de gene de rezistenţă prezente la cartof (Cockerham, 1970; de Bokx şi Huttinga, 1981; Kerlan 2006; Singh şi colab., 2008). Un grup de tulpini determină un răspuns de rezistenţă prin hipersensibilitate (HR) datorită genei Ny, numit PVY0, iar cele care determină rezistenţă prin hipersensibilitate datorită genei Nc, au fost numite tulpini PVYC (Tabelul 1). A fost acceptată şi existenţa unei gene de rezistenţă adiţionale Nz, bazată pe reacţii de rezistenţă prin hipersensibilitate (HR) a unui grup de tulpini PVYZ, care nu determină rezistenţă prin hipersensibilitate în prezenţa genelor Ny sau Nc, însă, exercită rezistenţă prin hipersensibilitate la soiuri precum Maris Bard şi Pentland Ivory, purtătoare ale acestei presupuse gene Nz (Jones, 1990; Singh şi colab., 2008).

 

Tabelul 1. Clasificarea genetică a tulpinilor PVY în funcţie de proprietăţile serologice şi moleculare ale principalelor tulpini genetice PVY. (Singh și colab, 2008;  Dullemans și colab. 2011; Kerlan și colab 2011; Galvino-Costa și colab. 2012)

 

PVYO PVYC PVYZ PVYN PVYE
Cartof cvs. Désirée, Pentland Crown (Ny:nc:nz) HR s s s s
Cartof cv. King Edward (ny:Nc:nz) s HR s s s
Cartof cvs. Maris Band, Pentland Ivory (Ny:Nc:Nz) HR HR HR s s
Tutun moz moz moz VN moz
Serotip O O N N N
Tipul genomului NR NR R NR R

 

HR – rezistenţa prin reacția de hipersensibilitate; s – susceptibil (sensibil); moz – mozaic;

VN –  necroze ale nervurilor; O – serotip PVYO; N – serotip PVYN; NR – nerecombinat;

R – recombinat

 

Izolatele care nu determină rezistenţă prin hipersensibilitate faţă de nici una dintre genele N prezente la cartof (Ny, Nc şi Nz), ar putea fi distinse pe baza reacţiilor manifestate la tutun (Tabelul 1) – cele care determină necrozarea nervurii la tutun, au fost clasificate în tulpini PVYN (Jones, 1990; Singh şi colab., 2008), iar cele care determină numai mozaic, au fost clasificate în tulpini PVYE (Kerlan şi colab., 1999; Singh şi colab., 2008). Dintre aceste cinci grupuri de tulpini PVY, numai PVYN determină necrozarea nervurii la tutun (Tabelul 1) şi ca urmare, a fost denumită tulpina „necrotică” a PVY (Cockerham, 1970; deBokx şi Huttinga, 1981, Boonham şi colab., 2002). Este important de ştiut că această clasificare genetică (Tabelul 1) include două grupuri de tulpini, PVY0 şi PVYN, care sunt complet caracterizate din punct de vedere molecular, prin metode serologice, Real Time – PCR (RT-PCR) şi întregul genom este secvenţiat, însă, apar şi alte două grupuri de tulpini, PVYZ şi PVYE, ale căror proprietăţi moleculare nu au fost studiate până în prezent (Kerlan şi colab., 2011, Galvino-Costa şi colab., 2012).

 

Clasificarea moleculară a recombinatelor PVY

Se cunosc secvenţele întregului genom pentru izolatele nerecombinate ale grupurilor de tulpini aparţinând virusurilor: PVY0, PVYC şi PVYN (Robaglia şi colab., 1989; Turpen, 1989; Nie şi Singh, 1996; Lorenzen şi colab., 2006a; Fomicheva şi colab., 2009; Dullemans şi colab., 2011; Karasev şi colab., 2011). Alături de aceste genomuri parentale principale, au fost descoperite mai multe genomuri recombinate ale PVY, construite pe segmente ale secvenţelor PVY0 şi PVYN, împărţite în diferite combinaţii (Thole şi colab., 1993; Jakab şi colab., 1997; Glais şi colab., 1998, 2002a,b; Boonham şi colab., 2002; Nie şi Singh, 2003b; Lorenzen şi colab., 2006a; Chikh Ali şi colab., 2007, 2008; Schubert şi colab., 2007; Hu şi colab., 2009b, 2011; Karasev şi colab., 2011; Galvino-Costa şi colab., 2012). Au fost descoperite cel puţin nouă modele de recombinare cu PVY0 şi PVYN identificaţi ca ”părinţi”, având la bază analizele secvenţelor mai multor genomuri PVY cunoscute până la acea dată (Hu şi colab., 2009a). Aceste modele recombinate au între 1 şi 4 joncţiuni recombinate (RJs), care în majoritate, îşi păstrează relativ poziţia din genomul PVY, în special în regiunile P1, HC-Pro şi VPg-NIa (Hu şi colab., 2009a).

Figura 8. Principalele tulpini recombinate PVY identificate în Europa şi în America de Nord – PVYNTN şi PVYN-O şi PVYN-Wi. Zonele delimitate marchează  originea fragmentelor genomului pentru secventele parentale PVY N (gri) şi PVY O (alb). Poziţia zonelor de joncţiune recombinate RJ 1 şi 4, adesea utilizate pentru a distinge tulpinile recombinate PVY, sunt specificate în partea inferioară a diagramei. Cele 10 gene PVY sunt menţionate în partea superioară a figurii.

Cele trei caracteristici ale modelelor de recombinare frecvent întâlnite la PVYNTN, PVYN:O şi PVYN-Wi sunt prezentate în figura 8, fiind indicată şi poziţia RJs corespunzătoare. Toate cele patru RJs indicate în figura 8 au fost testate pentru o posibilă utilizare ca instrument de diferenţiere, pentru scrierea recombinatelor PVY. În prezent, sunt disponibile mai multe seturi de primeri bazate pe polimorfismul unei singure nucleotide din jurul acestei joncţiuni recombinate (RJs), utilizate în reprezentarea recombinatelor PVY într-un format R-T – PCR uniplex sau multiplex (Nie şi Singh, 2002, 2003a; Boonham şi colab., 2002; Lorenzen şi colab., 2006b; Rigotti şi Gugerli 2007; Chikh Ali şi colab., 2010).

De asemenea, au fost raportate genomuri nerecombinate PVYNA-N (Nie şi Singh, 2003 b) şi recombinate, de exemplu NE-11 (Lorenzen şi colab., 2008), semnificativ diferite de PVY0 şi PVYN. Cele mai multe din aceste variante recombinate PVY, au fost studiate doar prin metode de laborator şi singura caracterizarea biologică efectuată pe unele dintre ele a fost testul pe tutun (Tabelul 2). Interesant, în cazul în care a fost folosit numai acest test pe tutun pentru tulpina PVY, aproape toate recombinările PVY au indus necroza nervurii la tutun şi astfel, ar fi fost de tipul PVYN (Tabelul 2). Datorită felului lor recombinat, unele grupuri ale tulpinii PVY, ca PVYN:O şi PVYN:Wi, au păstrat simptomatologia serotipului PVYO şi PVYN pe tutun, creând dificultăţi în diferenţierea corectă a izolatelor PVY. Grupul tulpinii recombinate PVYNTN (Tabelul 2) a atras cea mai mare atenţie, din moment ce a răspuns prin necrozarea tuberculilor, de exemplu sindromul PTNRD şi a fost asociat cu modelul recombinării (Beczner şi colab., 1984; Le Romancer şi colab., 1994; Glais şi colab, 2002b). Astfel, izolatele multiple recombinate ale PVY sunt acum clasificate în mare măsură pe baza proprietăţilor genomurilor acestor izolate – numărul şi poziţia încrucişării recombinate, care pot fi determinate prin analiza RT-PCR sau prin secvenţierea genomului. Reacţia tutunului nu este foarte utilă în diferenţierea recombinărilor PVY, din moment ce, cele mai multe dintre ele, induc necroza nervurii la tutun (Tabelul 2). De asemenea, din punct de vedere serologic, pe baza serotipurilor PVYO şi PVYN identificate prin anticorpi monoclonali, aceast mod de identificare are o utilitate limitată în diferenţierea recombinărilor izolate ale PVY, din moment ce, PVYN:O/N-Wi nu se poate distinge de forma nerecombinată PVYO, sau PVYNTN de nerecombinata PVYN (Tabelul 2). Foarte puţine dintre izolatele recombinate au fost testate pe plante test (de diferenţiere) sau indicatoare pentru cartof (Tabelul 1), pentru a determina caracterul genetic (excepţie fac lucrările  Barker şi colab., 2009; Kerlan şi colab., 2011; Galvino-Costa şi colab., 2012). De aceea, cele două clasificări, cea genetică şi cea moleculară rămân separate, creând confuzii şi făcând dificilă descifrarea biologiei tulpinii PVY, caracterizată printr-o complexitate de excepţie.

 

Tabelul 2. Caracteristici ale grupelor de tulpini PVY clasificate pe baza proprietăţilor genomului (Singh și colab, 2008;  Lorenzen și colab. 2008; Barker și colab. 2009; Kerlan și colab 2011; Galvino-Costa și colab. 2012)

PVYO PVYC PVYN PVYE  

PVYN-Wi

PVYN:O PVYNTN  

PVYNA-N

NE-11
Tutun moz moz VN moz VN VN VN VN VN
Serologie O O N N O O N N N
Genom NR NR NR R R R R NR R
Număr  RJs 0 0 0 4+ 2 1 3-4 0 2+
N gena specifică Ny Nc ? ? Nz ? ?

Moz – mozaic

VN – necrozare nervuri

 

O problemă aparent minoră, tehnică, de clasificare a combinaţiei genetice și moleculare pentru tulpinile PVY, a solicitat un efort uriaş, datorită intervenţiei a doi factori, enumerați mai jos.

       Primul factor se referă la faptul că, doar un grup oarecum restrâns de cercetători a folosit plante indicator (test) similare pentru tulpinile PVY – aceşti indicatori au fost reprezentaţi în special de soiuri europene vechi de cartof, nefiind universal disponibile în toate ţările care se confruntă cu probleme legate de răspândirea PVY. Pentru a rezolva problema disponibilităţii acestor indicatori biologici, tutunul a devenit planta test (la alegere), acolo unde cercetătorii nu dispuneau de soiurile indicatoare consacrate de cartof. S-a recurs la această substituire a  indicatorilor biologici, tocmai pentru a favoriza concentrarea eforturilor tuturor grupurilor de cercetare implicate în studierea tulpinilor recombinate PVY şi în special, pentru diferenţierea acestora faţă de cele din grupul de tulpini PVYN (Boonham şi colab., 2002). Se consideră că aceste tulpini recombinate ar putea depăşi toate genomurile de rezistenţă N la cartof. Din păcate, aproape toate tulpinile recombinate testate, au indus necroza nervurilor la tutun şi astfel, au fost imposibil de distins de PVYN (Tabelul 2).

Al doilea factor se referă la schimbările rapide în compoziţia tulpinilor PVY izolate, tulpini care au circulat odată cu importurile de cartof pentru sămânţă în Europa de Vest, în perioada de sfârşit a anilor 1980 şi începutul anilor 1990; efectul profund al acestor schimbări a devenit evident abia mai târziu, când s-au dezvoltat instrumente moleculare sigure în identificarea tulpinilor PVY (Nie şi Singh, 2002, 2003a; Boonham şi colab., 2002; Lorenzen şi colab., 2006b; Rigotti şi Gugerli, 2007; Chikh Ali şi colab., 2010). În mod special, anumite tipuri ale tulpinilor PVY caracterizate genetic, cum ar fi PVYC şi PVYN au fost înlocuite, în general de tipuri noi, recombinate, cum ar fi PVYN-Wi, PVYN:O şi PVYC, care sunt caracterizate din punct de vedere genetic (Blanchard şi colab., 2008; Kerlan şi Moury, 2008). Unele dintre tulpinile recombinate, cum ar fi PVYNTN, iniţial au fost observate datorită asocierii lor cu noi boli la cartof, cum ar fi Pătarea Inelară Necrotică a Tuberculilor (PINT) PTNRD (Beczner şi colab., Le Romancer şi colab., 1994).

De-a lungul anilor 1990 şi 2000, pentru a distinge diferite tipuri de tulpini recombinate PVY, au fost utilizate instrumente moleculare. Au existat încercări în aplicarea unor instrumente moleculare de tip vechi, în cazul tulpinilor istorice PVY, cum ar fi PVYZ şi PVYE (Kerlan şi colab., 1999; Singh, 2009, Kehoe şi Jones, 2011); dar, acestea nu au dat rezultate satisfăcătoare, deoarece izolatele vechi au pierdut puterea lor de infecţie, datorită perioadei prea lungi de stocare. Unele date preluate de la materialul neinfecțios cu PVY la origine, au arătat, pentru tulpina N serologică sau pentru PVYO, secvenţa protein-capsidale prezentă, şi prin urmare, acestea au prezentat contradicţii. Cercetarea izolatelor PVYZ şi PVYE în câmpurile izolate PVY a fost cea mai bună strategie în caracterizarea acestor tulpini istorice.

În 2008, a fost publicat un articol referitor la sămânţa de cartof (Singh şi colab., 2008). Acesta a atras atenţia asupra lipsei caracterizării biologice a tulpinilor recombinate PVY a soiurilor de cartof cu fond genetic definit. Problema a devenit foarte practică – PTNRD în mod clar nu a fost limitată doar la PVYNTN; au fost necesare instrumente noi, specifice, în identificarea PTNRD (în inducerea tulpinilor PVY) (Singh şi colab., 2008, Gray şi colab., 2010). Instrumentele moleculare şi serologice au fost utile în distingerea diferitelor tulpini recombinate ale PVY, dar s-a putut preciza, doar dacă o anumită formă recombinată sau un anumit izolat ar induce PTNRD pentru un anumit soi de cartof. Articolul (Singh şi colab., 2008) a trezit din nou interesul privind clasificarea genetică a tulpinilor PVY şi a iniţiat apariţia unui număr uriaş de publicaţii, în care au fost abordate recombinările genetice ale PVY pe plantele test. Astfel, a fost realizat un progres semnificativ în caracterizarea biologică a tulpinilor recombinate PVY din 2008 (Barker şi colab., 2009; Kerlan şi colab., 2011; Galvino-Costa şi colab., 2012). Acest progres s-a bazat pe caracterizarea biologică a izolatelor PVY inoculate pe indicatori – plante test şi concomitent, pe întreaga secvenţiere a genomului. Important este că, a fost determinată structura moleculară a două tulpini genetice de PVY, pentru PVYZ (Kerlan şi colab., 2011) şi PVYE (Galvino-Costa şi colab., 2012).

Figura 9. Diagrama unor tulpini recombinate rare PVY, PVYE, cu genomul alcătuit din două genomuri parentale PVYNE -NE-11 şi PVY-NTN (Galvino-Costa și colab. 2012). Poziţia a două joncţiuni recombinate, RJ2 şi RJ3, caracteristice pentru PVY-NTN este specificată în partea inferioară a diagramei. Dacă numai RJ2 şi RJ3 sunt vizate utilizând tehnica multiplex RT-PCR (Lorenzen și colab. 2006b), PVYE va fi greşită pentru PVY-NTN.

 

Ambele genomuri PVYZ şi PVYE s-au dovedit a fi recombinate (Fig. 9 și 8), acestea fiind în concordanţă cu momentul colectării iniţiale şi caracterizării efectuate în anii 1980 şi începutul anilor 1990 (Jones 1990; Kerlan şi colab., 1999). PVYE a reprezentat o nouă tulpină recombinată asociată cu PTNRD (Galvino-Costa şi colab., 2012), cu genomurile parentale identificate ca PVYNTN şi PVY-NE, ele însele recombinate (Lorenzen şi colab., 2006 a, 2008). Pe de altă parte, PVYZ s-a dovedit a avea un genom bine cunoscut PVYNTN, de mult ştiut ca fiind asociat cu PTNRD (Hu şi colab., 2009 b, Kerlan şi colab., 2011).            Această identificare a genomului PVYZ, având ca structură pe cea a PVYNTN, a fost o veritabilă surpriză şi a iniţiat un studiu privind interacţiunile izolatelor comune PVYNTN cu gena de rezistenţă Nz, prezentă în soiul Maris Bard (Kerlan şi colab., 2011; Tabelul 1). Caracterizarea biologică ulterioară a patru izolate PVYNTN suplimentare pe soiurile Désirée, King Edward şi Maris Bard, a indicat că două dintre ele au indus HR tipică, şi două HR grave, locale şi sistemice – cum ar fi necroze în Maris Bard, în timp ce nu s-a produs HR sau necroza sistemică pentru soiurile Desirée şi King Edward (Kerlan şi colab., 2011; Galvino-Costa şi colab., 2012). O reacţie similară a fost raportată de către Barker şi colab. (2009), pentru un izolat PVYNTN– PVYNTN – Slo în Maris Bard, adică HR locală şi sistemică, în timp ce pe soiurile Desirée, Pentland Crown, King Edward şi Duke de York nu s-a observat nici o HR. Aşadar, se pare că ambele grupuri de tulpini PVYZ şi PVYNTN declanşează HR în soiuri, adăpostind gene Nz (Kerlan şi colab., 2011); diferenţele între tulpinile PVYZ şi PVYNTN sunt indicate de simptomele induse plantelor de tutun: PVYZ induce mozaicul şi clarifierea nervurilor, în timp ce PVYNTN induce necroze ale nervurilor (Tabelele 1 şi 2). Ca urmare a acestor constatări, Kerlan şi colab. (2011) au propus ca PVYZ şi PVYNTN să fie considerate foarte aproapiate, chiar identice din punct de vedere biologic la cartof şi să fie numite PVYZ-NTN. Într-o clasificare genetică îmbunătăţită, s-a propus ca simptomele pe tutun să fie subordonate simptomelor soiurilor indicatoare de cartof (Kerlan şi colab., 2011). Prin urmare, două din cele cinci tulpini originale, istorice ale PVY, s-au dovedit a avea gene recombinate (Tabelul 1).

Noutăţi, informaţii privind unii patogeni emergenţi ai culturii cartofului (deocamdată despre virusul Y din zona Braşov) şi alte date utile pentru cei care activează pe filiera cartofului (fermieri şi producători, distribuitori etc)

Lasă un răspuns