Infecţiile cu unele virusuri care infectează cartoful – virusul A (PVA), Y (PVY) sau virusul răsucirii frunzelor (PLRV)- duc la apariţia unor simptome distinctive; alţi agenţi patogeni (PVM sau PVS) sunt virusuri latente care adesea nu produc simptone vizibile. Acestea pot fi detectate numai prin testele cu plante indicatoare, microscopie electronică sau teste serologice. Virusurile care cauzează simptome foliare sunt controlate pentru identificarea şi certificarea directă, periodică, asupra materialului biologic. Până recent, virusurile latente au fost acceptate nu doar datorită faptului că nu existau surse de material biologic disponibil, liber de astfel de virusuri, ci şi datorită lipsei tehnicii de laborator necesare pentru identificarea lor. În prezent, obţinerea de plantule libere de viroze aparţinând unui sortiment larg de soiuri şi varietăţi, este din ce în ce mai mult utilizată datorită perfecţionării metodelor de cultură a meristemelor izolate din plante pretratate termic, pe medii nutritive “in vitro”, perfect controlate.

Înainte de începerea procedurilor de eliminare a virusurilor din plantele de cartof trebuie testată starea de sănătate iniţială a plantelor donoare de meristeme, în scopul reducerii semnificative a numărului de testări şi determinări ce trebuie aplicate fiecărei plantule obţinută în cultura “in vitro”. Chiar dacă toate tipurile de virusuri pot fi eliminate prin aceleaşi proceduri de laborator, iar aplicarea metodei care elimină virusurile PVX şi PVS de obicei are efect şi asupra altor tipuri de virusuri, formele rezistente pot să rămână neafectate. Acestea se determină cu ajutorul plantelor test (indicatoare).

Probele pentru analiză se pot preleva în trei moduri:

-din frunzele plantelor crescute din colţi (TLC) sau tuberculi

-direct din tuberculi cu întreruperea artificială a repausului vegetativ

-din colţii tuberculilor, în cazul întreruperii pe cale naturală a repausului.

Până în prezent, în ţara noastra, pentru certificarea cartofului pentru sămânţă s-a utilizat la testare doar suc extras din plante crescute din colţi.  În acest scop, probele de suc s-au extras din frunzele plantelor crescute în seră, plante obţinute din colţii tuberculilor la care s-a efectuat întreruperea artificială a repausului vegetativ. Deşi metoda este aplicată pe scară largă pentru testarea materialului clonal şi în programele de certificare a cartofului pentru sămânţă, ea are şi câteva dezavantaje legate în special de durata completă a testului şi consumul de energie.

Pentru determinarea gradului de infecţie cu virusuri s-a utilizat Testul ELISA (enzime-linkeed immunosorbent assay). Testul Elisa este un test imunologic foarte sensibil al cărui principiu se bazează pe interacţiunea antigen anticorp. Sensibilitatea acestui test este de 1000 de ori mai mare decât a testului de aglutinare. Aceasta permite evidenţierea sigură a unor concentraţii scăzute de virus. Probele necesare pot fi mici şi în principiu la plantele “in vitro” se foloseşte întreaga plantă.

 

            Testarea virotică prin tehnica DAS ELISA (probe prelevate din frunze). Principiul metodei.

            Există mai multe variante ale testului ELISA, în funcţie de modul de executare. Pentru identificaera infecţiilor cu principalele virusuri ale cartofului se foloseşte de obicei aşa numitul tip “dublu anticorpi sandwich” (anticorpii adsorbiţi de faza solidă, leagă antigenul, iar complexul format leagă apoi conjugatul). Ca faza solidă se folosesc plăci microtest.

Anticorpii specifici pentru identificarea viruşilor se formează în animale (iepuri) în sistemul lor imunitar, se îmbogăţesc în sănge şi de aici se separă serul imun prin decantare şi centrifugare, din care apoi se separă fracţia cea mai activă şi anume imunoglobinele G. În acest scop anticorpii din serul imun se precipită cu soluţie saturată de sulfat de amoniu iar după centrifugare sunt resuspendaţi în tampon fosfat salin. Apoi ionii de amoniu sunt eliminaţi prin dializă repetată, soluţia cu anticorpi este filtrată printr-o coloană cu DEAE 52 celuloză iar concentraţia fracţiilor colectate se determină spectofotometric la 280nm. În final se ajustează concentraţia la 1 mg/ml (OD=1,4-1,8) prin amestecarea treptată a fracţiilor colectate şi citiri repetate la spectofotometru. Acest antiser se utilizează atăt la tratarea microplăcilor, cât şi la realizarea conjugatelor, prin cuplarea (marcarea) anticorpilor cu enzima fosfatază alcalină. Ca agent de cuplare a anticorpilor cu enzima se utilizează glutaraldehida.

Conjugatul este format din anticorpi cuplaţi cu o enzimă, în cazul nostru cu fosfatază alcalină. Această enzimă scindează substratul şi răspunde în final de evidenţierea vizuală sau fotometrică a prezenţei virusurilor. Pentru evidenţierea fotometrică este necesar un substrat. Acest substrat este para-nitro fenil fosfat. Sub acţiunea enzimei (fosfatază alcalină) substratul se scindează şi se formează para nitrofenolul care are culoare galbenă.

Rata de scindare a substratului este cu atât mai mare cu cât sunt cuplate mai multe molecule de enzimă în alveolele plăcii. Deoarece IgG marcat cu enzimă este ataşat de complexul anticorp-antigen, moleculele de enzimă pot apărea pe placă numai atunci când în proba cercetată se găsesc particule de virus. Prin urmare apariţia şi intensitatea culorii depinde de prezenţa şi concentraţia virusului.

Interpretarea poate fi vizuală şi fotometrică, cea din urmă fiind mult mai exactă. Astfel cu ajutorul unui spectrofotometru se măsoară extincţia la lungimea de undă 405 mm.

Principalele etape ale tehnicii ELISA (figura 7) sunt următoarele:

  1. TRATAREA MICROPLĂCILOR (ALVEOLELOR)

Mai întâi se diluează IgG (imunoglobulina) în tampon carbonat cu pH 9,6, apoi se introduc căte 100-200micro-litri de IgG diluată în fiecare alveolă.

  1. INCUBAREA MICROPLĂCILOR

Microplăcile se acoperă cu grijă cu folie adezivă şi se introduc în camere umede sau pungi de PVC. Incubarea se face la o temperatură de 30-37º C timp 2-6 ore, în funcţie de temperatură.

  1. SPĂLAREA MICROPLĂCILOR

Spălarea constă în umplerea alveolelor de 3-4 ori cu tampon de spălare şi scuturarea lor energetică la golire. După ultima golire se bat plăcile pe un prosop absorbant sau hârtie de filtru pentru înlăturarea totală a tamponului. Spălarea trebuie făcută cu grijă, fiind extrem de importantă.

  1. ADĂUGAREA EXTRACTULUI DE PLANTE

Pentru extragerea sucului din microplante s-a utilizat o presă electrică cu valţuri netede. S-au pipetat câte 100-200 micro-litri extract/alveolă, după ce a fost diluat în prealabil 1:3-1.10 cu tampon de omogenizare.

  1. INCUBAREA MICROPLĂCILOR

Incubarea se face timp de 12-16 ore la temperatura de 2-8ºC, bine acoperite şi introduse în camera sau pungi de PVC. În această etapă virusul se fixează pe anticorp.

  1. SPĂLAREA MICROPLĂCILOR
  2. ADĂUGAREA CONJUGATULUI

Conjugatul este de fapt IgG cuolată cu o enzimă. Conjugatul se diluează cu tampon şi apoi se adaugă 100-200 micro-litri conjugat diluat în fiecare alveolă.

  1. INCUBAREA MICROPLĂCILOR

Se face timp de 2-5 ore la 30-37º C, acoperite şi introduse în camera umedă sau pungi PVC.

  1. SPĂLAREA MICROPLĂCILOR

Toate spălările s-au efectuat cu o maşină automată de spălat, iar pentru pipetările de la punctele A,D,şi J s-a utilizat multipipeta automată SUMAL AD-96.

  1. ADĂUGAREA SUBSTRATULUI

Această etapă începe cu dizolvarea 4-nitrofenilfosfatului în tampon substrat, în proporţie de 1 mg substrat/ml de tampon, după care se pun în fiecare alveolă căte 100-200 micro-litri de 4-nitrofenilfosfat diluat.

  1. INCUBAREA MICROPLĂCILOR

De această dată incubarea se face la temperatura camerei timp de 1-2 ore, la lumina naturală, plăcile fiind ferite de soare.

  1. MĂSURAREA EXTINCŢIEI LA 405 nm

Estimarea reacţiilor s-a efectuat cu cititorul automat PR 1100, care indică valoarea extincţiei pentru fiecare alveolă din microplăcile analizate. Citirea plăcilor s-a efectuat la 60-120 minute de la adăugarea substratului.

  1. ADĂUGAREA SUBSTRATULUI

Această etapă începe cu dizolvarea 4-nitrofenilfosfatului în tampon substrat, în proporţie de 1 mg substrat/ml de tampon, după care se pun în fiecare alveolă căte 100-200 micro-litri de 4-nitrofenilfosfat diluat.

  1. INCUBAREA MICROPLĂCILOR

De această dată incubarea se face la temperatura camerei timp de 1-2 ore, la lumina naturală, plăcile fiind ferite de soare.

  1. MĂSURAREA EXTINCŢIEI LA 405 nm

 

Estimarea reacţiilor s-a efectuat cu cititorul automat PR 1100, care indică valoarea extincţiei pentru fiecare alveolă din microplăcile analizate. Citirea plăcilor s-a efectuat la 60-120 minute de la adăugarea substratului.

Fig 2. Etapele principale ale tehnicii de testare virotică DAS ELISA.

 

Testarea virotică prin tehnica DAS ELISA (probele prelevate direct din tuberculi)

Efectuarea analizelor direct pe tuberculi permite unele îmbunătăţiri ale procesului de testare virotică, prin aplicarea unei tehnologii care:

– necesită o durată redusă (nu se mai aşteaptă 6-8 săptămâni pentru obţinerea de plante în seră, plante de la care se prelevau frunzele necesare pentru testare) ;

– elimină consumul de apă necesar dezvoltării plantelor ;

– elimină utilizarea unor eventuale pesticide folosite pentru combaterea dăunătorilor din sere (impact ecologic asupra mediului) ;

– elimină consumul de energie termică şi electrică necesar pentru a asigura condiţiile de creştere a plantelor din sere .

Tehnica ELISA aplicată direct pe tubercul reduce perioada de efectuare a analizelor, oferind posibilitatea de a efectua selecţia materialului sănătos la scurt timp după recoltare, evitându-se întârzierile datorate eventualelor probleme care apar de obicei la creşterea plantelor în seră. Totodată, prin scurtarea perioadei de testare, certificarea cartofului pentru sămânţă în cazul unor soiuri timpurii se poate face într-un interval mai scurt, ceea ce permite cultivatorilor să cunoască gradul de infecţie al materialului de plantat chiar înainte de a-l însiloza. Devansarea certificării în precultură a cartofului pentru sămânţă vine în sprijinul fermierilor, care ar putea valorifica în timp util producţia obţinută.

La testul ELISA din tuberculi şi colţi, etapele care diferă faţă de metoda din frunze sunt: pregătirea tuberculilor, modul de prelevare şi distribuire a extractului (figura 2).

Pentru testul ELISA direct din tuberculi, sucul de plantă este extras, diluat si distribuit direct în plăci utilizând un burghiu dentar modificat şi un sistem automat de absorbţie, diluţie şi repartizare a amestecului de soluţie tampon de extracţie şi extract vegetal (figura 3).

Testarea ELISA cu prelevarea probelor direct din tuberculi este mai rapidă, implică o perioadă de testare mai scurtă comparativ cu testul din frunze, dar are unele dezavantaje

– o detectare satisfăcătoare a virusurilor PVY si PVA se face numai dacă tuberculii au fost trataţi cu Rindite şi s-au respectat condiţiile de temperatură şi umiditate necesare pentru o încolţire corespunzătoare şi pentru evitarea deshidratării tuberculilor;

– randament mai redus datorită modului de extracţie şi de umplere a microplăcilor (extracţia probei din tubercul necesită mai mult timp comparativ cu cea realizată din frunze, cu presa electrică);

– o detectabilitate ceva mai redusă a testului în cazul nerespectării condiţiilor de pregătire a tuberculilor înainte de testare.

Testul ELISA din colţi se poate face în timpul perioadei de depozitare, utilizând tuberculi încolţiţi pe cale naturală. Colţii prelevaţi în pungi de plastic sunt zdrobiţi şi omogenizaţi cu soluţie de tampon de extracţie, după care probele sunt pipetate manual în plăci. Printre avantajele metodei amintim:

– este singura posibilitate de testare ELISA a tuberculilor cu întreruperea naturală a repausului germinativ;

– se reduc costurile necesare pentru întreruperea artificială a repausului  şi pentru     creşterea plantelor în sere;

– se păstrează intact materialul testat deoarece starea fiziologică a tuberculilor nu    este afectată nici în timpul şi nici după prelevarea probelor.

Prelevarea probelor din colţi implică următoarele dezavantaje:

– detectarea virusului răsucirii frunzelor (PLRV) este posibilă doar dacă mărunţirea ţesutului vegetal este realizată corespunzător (având în vedere localizarea virusului în floem,prin sistemul de prelevare a probelor este posibil uneori ca membrana celulelor conducătoare să nu fie distrusă şi în consecinţă, virusul să nu ajungă în extractul pentru testare);

– randament ceva mai redus, datorat în principal modului de prelevare pentru testare.

Fig. 3. Pregătirea tuberculilor şi prelevarea probelor pentru testul ELISA.

Noutăţi, informaţii privind unii patogeni emergenţi ai culturii cartofului (deocamdată despre virusul Y din zona Braşov) şi alte date utile pentru cei care activează pe filiera cartofului (fermieri şi producători, distribuitori etc)

Lasă un răspuns